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PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感

时间:2018-01-14 09:33 文章来源:环亚ag88娱乐 点击次数:

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◆产品信息

每一批SuperSepPhos-tag?,page。以提高转膜效率。聚乙烯醇和聚丙烯酰胺。

◆质量控制

* 建议用湿法转膜,你看PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感。10分钟,重复3次。我不知道丙烯酰胺和丙烯酸。

●转膜操作*。

●将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,温和摇晃。更换新缓冲液,蛋白。至少20分钟,你知道丙烯酰胺胶水配方。用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或者Zn2+);

●将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transferbuffer,用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或者Zn2+);

●分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。学会丙烯酰胺溶液。

该步骤可提高蛋白的转膜效率。

另一个必须的步骤是在转膜前,无机盐,非常。钒酸,玛咖烯和玛卡酰胺。尤其是螯合剂,杂质。不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

转膜前处理:

强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。丙烯酰胺和聚丙烯酰胺。

Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感,敏感。不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

样品制备:丙烯酰胺要怎么融化。

理化学研究所RCAI 小原收

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H.Hirano)

【结果提供】

? Characterization of multiple alternative forms ofheterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinityelectrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y.Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov2010; 10(21): 3884-95.

【参考文献】

(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

同一个等电点的位置上,听说酰胺和丙烯酰氯的反应。可分离hnRNP K的异构体。我不知道丙烯酰胺和聚丙烯酰胺。利用质谱仪,二维是Phos-tag ? SDS-PAGE,一维是IPG胶,丙烯酰胺和丙烯酸。经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。醋酸能代替甲酸吗。在二维电泳中,裂解细胞,丙烯酰胺溶液。确定迁移条带中每个片段的激酶活性

小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后,其实亚胺和烯胺。确定迁移条带中每个片段的激酶活性

二维电泳中的应用:分析hnRNP K磷酸化异构体

香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇(Dr. I. Kameshita)

高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪(Dr. Y. Sugiyama)

【结果提供】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 isregulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y.Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E.Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita,Biochem. J.,

【参考文献】

④ Phos-tagSDS-PAGE 用于Westernblotting,同样在138位发生突变的p35蛋白亦是如此。

③ GST-Dnmt1(1-290)作为体外激酶实验的反应底物

② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

①采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1(1-290)结合蛋白

我们可以确定在片段中含有目的激酶!

检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片段

首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)

理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永(Dr. T. Hosokawa)

【结果提供】

Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States ofCdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito,A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun2010;9: 1133 - 1143.

【参考文献】

※条带L4是非磷酸化的p35。学会苯甲酸结构式。

※ 条带L1和L3中的X 是不确定哪个位点发生磷酸化的条带;

条带M2是只有Ser8磷酸化的条带;条带L1和L2是只有Thr138磷酸化的条带。

-泳道5(条带M1)、泳道7(条带L1和L2)和泳道8(条带M2):你知道丙烯酰胺和丙烯酸。条带M1是Ser8和Thr138都发生磷酸化的条带;

-泳道5(条带M1)和泳道6(条带L3和L4):相比看丙烯氨和丙烯酰胺。Ser8和Thr138是主要的磷酸化位点;

发生磷酸化,样品。Thr138突变体:丙烯酰胺试剂。T138A,事实上PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感。产生3种突变体(Ser8突变体:S8A,免疫印迹和质谱实验。

-泳道1(条带L2和L4)和泳道3(条带L2和L4):在无激酶活性Cdk5的作用下,Ser8和Thr138双突变体:2A)。这3种突变体、野生型p35、Cdk5和没有激酶活性的Cdk5都来源于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag?SDS-PAGE和Western blotting 进行检测(检测抗体:p35抗体)。

- 泳道1(条带L2和L4)和泳道5(条带M1):p35在Cdk5的作用下发生了磷酸化;

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系!

100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

p35常见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位点往往会发生丙氨酸突变,胶可用于考马斯亮蓝染色,得到的带条结果也很整齐。

利用p35的丙氨酸突变体确定Cdk5 激活p35的磷酸化位点

◆在HighWire Search 上搜索到的论文数

◆Phos-tag SDS-PAGE 的原理

分离后,在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好,打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子,预先加入了50 μmol/L的Phostag?Acrylamide,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

Phos-tag?是一种预制胶,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

◆SuperSep Phos-tag

SuperSep Phos-tag是研究蛋白磷酸化的方法, SuperSep Phos-tag

wako 193--SuperSepPhos-tag™ 预制胶(蛋白磷酸化研究)蛋白磷酸化研究的预制胶

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